פתיחת המסתורין של קיפול חלבון בעזרת מיקרוסקופיה מתקדמת

חוקרים קידמו את ההבנה של דינמיקת חלבון הממברנה על ידי חקר בקטריורודופסין (bR) עם שיטות חדשניות המשלבות מיקרוסקופיה של כוח אטומי וטריגרים של אור.

בכל הנוגע לפיתוח תרופות, לחלבוני הממברנה יש תפקיד מכריע, כאשר כ-50% מהתרופות מכוונות למולקולות אלו. הבנת התפקוד של חלבוני הממברנה הללו, המתחברים לממברנות התאים, חשובה לעיצוב השורה הבאה של תרופות חזקות. לשם כך, מדענים חוקרים חלבוני מודל, כגון bacteriorhodopsin (bR), אשר, כאשר הוא מופעל על ידי אור, שואב פרוטונים על פני קרום התאים.

בעוד ש-bR נחקר במשך חצי מאה, פיזיקאים פיתחו לאחרונה טכניקות להתבונן במנגנוני הקיפול והאנרגטיות שלו בסביבה המקומית של קרום הדו-שכבתי השומני של התא. במחקר חדש שפורסם על ידי הליכים של האקדמיה הלאומית למדעים (PNAS)JILA ו-NIST עמית תומס פרקינס וצוותו קידמו את השיטות הללו על ידי שילוב של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), כלי מדידה ננו-מדעי קונבנציונלי, עם מפעילי אור מתוזמנים מדויקים כדי לחקור את הפונקציונליות של תפקוד החלבון בזמן אמת.

"האנרגטיות של חלבוני הממברנה הייתה מאתגרת למחקר ולכן לא הובנה היטב", הסביר פרקינס. "באמצעות AFM ושיטות אחרות, נוכל ליצור דרכים לבחון זאת לעומק." חמושים בהבנה טובה יותר של האנרגטיקה של חלבונים אלה, כימאים יכולים לתכנן תרופות בעלות עוצמה רבה יותר לתסמינים ומחלות ספציפיות הנגרמות כתוצאה מתפקוד לקוי של חלבון

מדידת דינמיקת חלבון אלפית השנייה

בעוד bR הוא חלבון מיקרוסקופי, ניתן לראות אותו בעין בלתי מזוינת, ואפילו בתמונות לוויין, כאשר מיקרואורגניזמים ארכאוניים פורחים, הם משאירים כמויות עצומות שלו כשאריות בבריכות מים מלוחים. "הבריכות מתמלאות במה שנקרא Halobacterium salinarum, האורגניזם האב של בקטריורודופסין", פירט פרקינס. "הבריכות האלה משמשות לקצירת מלח, ומכיוון שהן חמות ומלוחות, החיידקים אוהבים לגדול שם."

ברמה המיקרוסקופית, bR עובד עם חלבוני ממברנה אחרים כדי לייצר אנרגיה עבור התא על ידי יצירת שיפוע פרוטונים בצד אחד של קרום התא, אשר מוביל את הפרוטון אל הצד השני של הממברנה. bR עושה זאת על ידי קיפול ופירוק הסלילים שלו לצורות ספציפיות כדי לשלוט בכמה פרוטונים עוברים דרך הממברנה. במהלך תהליך זה, נדידת הפרוטונים מייצרת אנרגיה כימית בצורה של אדנוזין-טרי-פוספט (ATP).

עבור פרקינס ומחברו דיוויד ג'ייקובסון (לשעבר חוקר פוסט-דוקטורט של JILA וכיום עוזר פרופסור באוניברסיטת קלמסון), bR הציג הזדמנות לתכנן שיטה ניסיונית חדשה להסתכלות על אנרגטיקה פונקציונלית בזמן אמת. כדי לחקור חלבונים כמו bR, ג'ייקובסון ופרקינס משתמשים ב-AFM, שמתנהג כמו אצבע זעירה למשוך את החלבון בעדינות, מה שעוזר ל-AFM להרגיש את פני החלבון, למפות את המבנה שלו ולתת הבנה טובה יותר של איך החלבון מתקפל. .

מכיוון שתהליכי הקיפול של bR מופעלים על ידי אור, פרקינס וג'ייקובסון הוסיפו אלמנט תאורה לנוהל AFM. "היה לנו רעיון חכם זה להדביק נוריות ירוקות סופר דקות – שמפעילות את הבקטריורודופסין – לפאק מתכת, שנוכל לחבר ל-AFM", פירט פרקינס. "נוריות הלד הירוקות האלה גם זולות, כמו $1.00 ליחידה או $1.50 ליחידה. לעומת שלוחה AFM שלנו, שעולה כ-80 דולר ליחידה, זריקת LED של 1.50 דולר היא בקושי משהו שאנו מודאגים ממנו".

עם התוספת הזולה הזו ל-AFM שלהם, פרקינס וג'ייקובסון יכלו לגרום ל-bR להתקפל ולהתפתח בדיוק של אלפיות השנייה. לאחר איסוף הנתונים שלהם, החוקרים גילו שהחלבון מתקפל בצורה נכונה 60% מהזמן, ומאפשר לפרוטונים לעבור דרך הממברנה.
כדי לאמת את האנרגטיקה והתפקוד בזמן אמת של קיפול החלבון, המדענים שינו את החלבון bR כך שיישאר תמיד במצב "פתוח" או לא מקופל. באמצעות מערך הניסוי החדש שלהם, הם יכלו לשחזר ממצאים דומים למה שהם צפו קודם לכן בשלב ה"פתוח" של מחזור הצילום של bR.

"בביולוגיה אולי תראה משהו, אבל אתה צריך לשאול, האם אני רואה את מה שאני חושב שאני רואה?" פרקינס אמר. "לכן, על ידי ביצוע מוטציה וראיית ההשפעה שציפינו לה, הגברנו את הביטחון שאנו באמת לומדים את התהליך שאנו חושבים שאנו חוקרים."

המסתורין של החלבון המקופל שגוי

בעוד פרקינס וג'ייקובסון הבחינו בקיפול תקין ב-60% מהמקרים, שאר 40% מהמקרים הפתיעו אותם, שכן החלבון התקפל בצורה לא נכונה אך עדיין יכול היה לשאוב פרוטון דרך הממברנה. "הקיפול השגוי למעשה מתייצב", הוסיף פרקינס. "וזה היה ממש מפתיע." במקרים רבים, קיפול שגוי של חלבון אינו גורם לייצוב.

בשל הייצוב האנרגטי, פרקינס וג'ייקובסון העלו תיאוריה שהסלילים המבניים של ה-bR אינם נפרדים כראוי כדי לספק מנהרה פתוחה לחלוטין לפרוטון, למרות שהוא עדיין התנועע דרכו, תהליך שקשה לזהות באמצעות הדמיית AFM.

בניסיון להבין טוב יותר את המנגנונים הבסיסיים לקיפול השגוי, פרקינס וג'ייקובסון הורידו את הכוח על מבחן המשיכה של AFM לאפס כדי לראות אם זה ישדל את החלבון להתקפל בצורה נכונה. עם זאת, התוצאות נשארו זהות: 40% מהמקרים הובילו לקיפול שגוי.
תוצאות אלו, עם אותה כמות של התקפלות שגויה, תמהו את החוקרים. בעוד פרקינס וג'ייקובסון לא הצליחו לזהות את הגורם למקרים שגויים אלה, הם מקווים לחקור עוד. כעת, הם מעוניינים לראות מה שאר קהילת הביופיזיקה עושה מהתוצאות הללו.

"יכול להיות שיש השפעות עדינות יותר, או אולי איזה מדע חדש שם", הוסיף פרקינס. "יכול להיות שיש מסלול שאולי אנשים לא יכלו לראות קודם לכן."