למרות שהספציפיות של עריכת גנים מבוססת CRISPR היא מדויקת ורב-תכליתית ביותר, היעילות של התקנת העריכות הללו הייתה נמוכה. במאמר זה, מעבדת אדמסון מתארת עורך ראשי יעיל יותר. קרדיט: קייטלין סדוויק מאוניברסיטת פרינסטון
מדעני פרינסטון עושים שיפור משמעותי בכלי לעריכת גנים מבוסס CRISPR הנקרא "עריכה ראשונית".
במהלך שנים של הנדסת מערכות לעריכת גנים, חוקרים פיתחו חבילת כלים המאפשרים שינוי של גנומים בתאים חיים, בדומה ל'ניתוח גנום'. כלים אלה, לרבות כאלה המבוססים על מערכת טבעית המכונה CRISPR/Cas9, מציעים פוטנציאל עצום לטיפול בצרכים קליניים שלא נענו, המודגש על ידי אישור ה-FDA האחרון של הטיפול הראשון מבוסס CRISPR/Cas9.
גישה חדשה יחסית שנקראת "עריכה ראשונית" מאפשרת עריכת גנים בצורה יוצאת דופן דיוק ורבגוניות גבוהה, אך יש לו פשרה קריטית: יעילות משתנה ולעיתים נמוכה של התקנת עריכה. במילים אחרות, בעוד שניתן לבצע עריכות ראשוניות בדיוק גבוה ומעט תוצרי לוואי לא רצויים, הגישה גם לרוב לא מצליחה לבצע את העריכות הללו בתדרים סבירים.
טכניקות עריכת Prime משופרות
במאמר שהופיע בדפוס בכתב העת טֶבַע ב-18 באפריל, 2024מדעני פרינסטון ג'ון יאן ובריט אדמסון, יחד עם כמה עמיתים, מתארים עורך ראשי יעיל יותר.
מחברים (lr) בריטני אדמסון, פרופסור עוזרת לביולוגיה מולקולרית ומכון לואיס-סיגלר לגנומיקה אינטגרטיבית; וג'ון יאן, סטודנט לתואר שני במעבדה אדמסון ומחבר ראשון. קרדיט: תמונה של בריט אדמסון מאת דניס אפלוויט, אוניברסיטת פרינסטון. תמונה של יוני יאן מאת המחבר.
מערכות עריכת Prime מורכבות באופן מינימלי משני רכיבים: גרסה שונה של אלמנט החלבון של CRISPR/Cas9 ו-ribonucleic חוּמצָה (RNA) מולקולה הנקראת pegRNA. רכיבים אלו פועלים יחדיו במספר שלבים מתואמים: ראשית, ה-pegRNA קושר את החלבון ומנחה את הקומפלקס שנוצר למקום רצוי בגנום. שם, החלבון חוטף את DNA ובאמצעות רצף תבנית המקודד על ה-pegRNA, "תמלל הפוך" עריכה לגנום הסמוך. בדרך זו, עורכים ראשיים "כותבים" רצפים מדויקים ל-DNA ממוקד.
"עריכת פריים היא כלי כל כך חזק להפליא לעריכת גנום מכיוון שהיא נותנת לנו יותר שליטה על איך בדיוק משתנים רצפים גנומיים", אמר אדמסון.
תובנות וחידושים ניסיוניים
בתחילת המחקר שלהם, אדמסון ויאן, סטודנטים לתואר שני בקבוצת המחקר של אדמסון ובמחלקה לביולוגיה מולקולרית, טענו שתהליכים תאיים לא ידועים עשויים לסייע או לעכב עריכת פריים. כדי לזהות תהליכים כאלה, יאן הציג תוכנית פשוטה מבחינה רעיונית: ראשית, הוא יהנדס קו תאים שיפלוט פלואורסצנטי ירוק כאשר יותקנו עריכות ראשיות מסוימות. לאחר מכן, הוא היה חוסם באופן שיטתי ביטוי של חלבונים המובעים בדרך כלל בתוך אותם תאים ומודד קרינה הנגרמת על ידי עריכה כדי לקבוע אילו מהחלבונים הללו משפיעים על עריכה ראשונית. על ידי ביצוע תוכנית זו, הצוות זיהה 36 גורמים תאיים של עריכה ראשונית, שרק אחד מהם – החלבון הקטן קושר ל-RNA La – קידם עריכה.
"למרות שקידום עריכת פריים הוא כמובן לא פונקציה נורמלית של חלבון La, הניסויים שלנו הראו שזה יכול להקל מאוד על התהליך", אמר יאן.
בתוך תאים, ידוע ש-La קושר רצפים ספציפיים שנמצאים לעתים קרובות בקצוות של מולקולות RNA קטנות המתהוות והוא מגן על ה-RNA הללו מפני השפלה. צוות פרינסטון זיהה מיד שה-pegRNAs שנפרסו בניסויים הראשונים של יאן הכילו ככל הנראה את הרצפים המדויקים, הנקראים מסלולי פוליאורידין, מכיוון שהם תוצר לוואי טיפוסי אך לעתים קרובות מתעלם ממנו של ביטוי pegRNA בתאים. ניסויים שלאחר מכן העלו כי pegRNAs כאלה רותמים בשוגג את פעילות הקצה של La להגנה ולקידום עריכה ראשונית.
פיתוח חלבון PE7
בהתבסס על התוצאות שלהם, הצוות שאל אם מיזוג החלק של La הקושר את דרכי הפוליאורידין לחלבון עריכה סטנדרטי יכול להגביר את יעילות העריכה הראשית. הם התרגשו לגלות שהחלבון שנוצר, שהם מכנים PE7, שיפר באופן משמעותי את יעילות העריכה הראשית המיועדת בתנאים שונים, וכאשר השתמשו בכמה מערכות עריכה ראשוניות, הותיר את התדרים של תוצרי לוואי לא רצויים נמוכים מאוד. התוצאות שלהם משכו במהירות את תשומת לבם של עמיתים המעוניינים להשתמש בעריכה ראשונית בתאים אנושיים ראשוניים, כולל דניאל באואר בבית החולים לילדים בבוסטון ובבית הספר לרפואה של הרווארד ואלכסנדר מרסון באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו. יחד עם מדענים ממעבדות אלה, צוות החוקרים המשיך והוכיח כי PE7 יכול גם לשפר את יעילות העריכה העיקרית בסוגי תאים רלוונטיים מבחינה טיפולית, ומציע הבטחה מורחבת ליישומים קליניים עתידיים.
"עבודה זו היא דוגמה יפה לאופן שבו בדיקה מעמיקה של פעולתם הפנימית של תאים יכולה להוביל לתובנות בלתי צפויות שעשויות להניב השפעה ביו-רפואית בטווח הקרוב", ציין באואר.
מימון: המימון לעבודה זו ניתן על ידי ה המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R35GM138167, RM1HG009490, T32HG003284, DP2CA239597, UM1HG012660 (מענק הכשרה של פרינסטון QCB; NHGRI), ו- (T32GM007388 מענק הדרכה של Princeton MOL); תוכנית החוקרים של Searle; יוזמת הקטליזה של פרינסטון; קרן CHDI; אוניברסיטת פרינסטון; מכון פארקר לאימונותרפיה נגד סרטן (PICI); פרס Lloyd J. Old STAR מטעם המכון לחקר הסרטן (CRI); קרן סימונס; יוזמת CRISPR Cures for Cancer; מכון קשת; CRUK/NIH (OT2CA278665 ו-CGCATF-2021/100006); פרס Pew-Stewart Scholars for Cancer Research; קרן דוריס דיוק; קונסורציום המחקר השיתופי של בית החולים לחקר הילדים של סנט ג'וד; NHLBI (R01HL150669); המרכז השיתופי למצוינות בהמטולוגיה של Fred Hutch (U54 DK106829); מועצת המלגות של סין (CSC), המבוססת על מזכר ההבנות של אפריל 2015 בין ה-CSC לאוניברסיטת פרינסטון; ה-NCI (K00CA245718); ומתקן משאבי ציטומטריית זרימה של אוניברסיטת פרינסטון (NCI-CCSG P30CA072720-5921).
מספרי מענק: R35GM138167, RM1HG009490, T32HG003284, DP2CA239597, UM1HG012660, T32GM007388, OT2CA278665, CGCATF-20021/105DK, CG2021/105 8, NCI-CCSG P30CA072720-5921
מממנים: מכונים לאומיים לבריאות (NIH), תוכנית חוקרים של סרל, יוזמת קטליזה של פרינסטון, קרן CHDI; אוניברסיטת פרינסטון, מכון פרקר לאימונותרפיה נגד סרטן (PICI), מכון לחקר הסרטן (CRI), קרן סימונס, יוזמת CRISPR Cures for Cancer, מכון Arc, CRUK/NIH, Pew-Stewart, קרן דוריס דיוק, מחקר שיתופי של בית החולים לחקר ילדים בסנט ג'וד קונסורציום, NHLBI, מרכז המצוינות השיתופית של פרד האצ' בהמטולוגיה, מועצת המלגות של סין (CSC), NCI.
