חוקרי UC San Diego פיתחו כלים חדשים לעריכת גנום, עורכי בסיס אורתוגונלי מרובים (MOBEs), המתקינים ביעילות מספר מוטציות נקודתיות בו-זמנית. כלי זה משפר את ההבנה והמודל של מחלות גנטיות על ידי מתן אפשרות להתקנת וריאנטים מבוקרת במעבדה, ומציע גישה חדשה לחקר מחלות מורכבות. קרדיט: twoday.co.il
MOBEs, כלי עריכת גנום חדשים מאוניברסיטת סן דייגו, מאפשרים שינויים גנטיים מדויקים בו-זמנית, משפרים מודלים של מחלות ופיתוח טיפולי.
הגנום האנושי מורכב מכ-3 מיליארד זוגות בסיסים, ובני אדם זהים ב-99.6% במבנה הגנטי שלהם. ה-0.4% הנותרים מסבירים הבדלים בין אנשים. שילובים ספציפיים של מוטציות בזוגות בסיסים אלו מספקים רמזים חיוניים לגבי הגורמים לבעיות בריאותיות מורכבות, כולל מחלות לב ומחלות ניווניות כמו סכיזופרניה.
שיטות מסורתיות למידול או תיקון מוטציות בתאים חיים אינן יעילות במיוחד, במיוחד בעת התקנת מוטציות נקודתיות מרובות בו-זמנית על פני הגנום. עם זאת, חוקרים מאוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו פיתחו כלים חדשים לעריכת גנום הנקראים עורכי בסיס אורתוגונלי מרובים (MOBEs) שיכולים להתקין ביעילות מספר מוטציות נקודתיות בו-זמנית. המחקר, בראשות פרופסור עוזר לכימיה וביוכימיה אלכסיס קומור, פורסם ב טבע ביוטכנולוגיה.
התפקיד של גרסאות נוקלאוטיד בודדות
החוקרים התמקדו בהשוואת גנומים הנבדלים בשינוי אות בודדת DNA. אותיות אלה – C (ציטוזין), T (תימין), G (גואנין), A (אדנוזין) – ידועות כבסיסים. כאשר לאדם אחד יש בסיס C, לאדם אחר יכול להיות בסיס T. אלה הם גרסאות נוקלאוטיד בודדות (SNVs) או מוטציות נקודתיות בודדות, לאדם עשויות להיות 4-5 מיליון גרסאות. בעוד שחלק מהווריאציות אינן מזיקות, אחרות מזיקות, ולעתים קרובות מדובר בשילוב שמעניק מחלה.
עורכי הבסיס האורתוגונלי המרובב שפותחו לאחרונה (MOBEs) ממזערים עריכות לא רצויות תוך השגת רמות גבוהות של יעילות. קרדיט: מעבדת אלכסיס קומור / UC San Diego
אתגרים במודלים של מחלות גנטיות
בעיה אחת בשימוש בגנום במודלים של מחלות היא המספר העצום של וריאציות אפשריות. אם מדענים היו מנסים לקבוע אילו מוטציות גנטיות אחראיות למחלות לב, הם יכלו לפענח את הגנום של קבוצה שכולם סבלו ממחלת לב, אבל מספר הווריאציות בין כל שני אנשים מקשה מאוד לקבוע איזה שילוב של וריאציות גורם למחלה .
"יש בעיה לפרש גרסאות גנטיות. למעשה, רוב הווריאנטים שזוהו אינם מסווגים קלינית, כך שאנו אפילו לא יודעים אם הם פתוגניים או שפירים", קבע קווין טי. קואן, דוקטור לאחרונה. בוגר המחלקה לכימיה וביוכימיה של האוניברסיטה ומחבר ראשון על המאמר. "המטרה שלנו הייתה ליצור כלי שניתן להשתמש בו במודלים של מחלות על ידי התקנת גרסאות מרובות בסביבה מעבדתית מבוקרת שבה ניתן ללמוד אותן עוד יותר."
אבולוציה של כלי עריכת גנים
כדי להבין מדוע נוצרו MOBEs, עלינו להבין את המגבלות של הכלי המסורתי לעריכת גנים CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 משתמש במדריך RNAשמתנהג כמו א ג'י.פי. אס אות שעובר ישר למיקום הגנומי שברצונך לערוך. Cas9 הוא האנזים קושר ה-DNA שחותך את שני גדילי ה-DNA, וגורם לשבירה מוחלטת.
למרות שהם פשוטים יחסית, הפסקות דו-גדיליות יכולות להיות רעילות לתאים. סוג זה של עריכת גנים יכול גם להוביל לאינדלים – אקראי בsertions ו delאציות – שבהן התא אינו מסוגל לתקן את עצמו בצורה מושלמת. עריכת גנים מרובים ב-CRISPR-Cas9 מכפילה את הסיכונים.
במקום CRISPR, המעבדה של קומור משתמשת בטכניקת עריכת בסיס שפיתחה, שעושה שינוי כימי ב-DNA, למרות שניתן לבצע רק סוג אחד של עריכה (C ל-T או A ל-G, למשל) בכל פעם. אז במקום מספריים שגוזרים קטע שלם בבת אחת, עריכת בסיס מוחקת ומחליפה אות אחת בכל פעם. הוא איטי יותר, אך יעיל יותר ופחות מזיק לתאים.
הקדמה של MOBEs
יישום בו-זמנית של שני עורכי בסיס או יותר (שינוי C ל-T במיקום אחד, ו-A ל-G במיקום אחר בגנום), מאפשר מודלים טובים יותר של מחלות פוליגניות – אלו המתרחשות עקב יותר מוריאנט גנטי אחד. עם זאת, בעבר אף טכנולוגיה לא יכלה ליישם ביעילות עריכות מרובות ללא "הצלבה" של RNA מדריך – עריכות לא מכוונות.
ה-MOBEs של Cowan משתמשים במבני RNA הנקראים aptamers – לולאות RNA קטנות הנקשרות לחלבונים ספציפיים – כדי לגייס אנזימים משנים בסיס למיקומים גנומיים ספציפיים המאפשרים עריכה בו-זמנית של מספר אתרים ביעילות גבוהה ושכיחות נמוכה יותר של הצלבה.
הוכחת עקרונות ויישומים עתידיים
מערכת זו היא חדשנית וזו הפעם הראשונה שמישהו השתמש בaptamers כדי לגייס ABEs (עורכי בסיס אדנוזין) בשילוב עם CBEs (עורכי בסיס ציטוזין) בדפוס אורתוגונלי כדי ליצור את ה-MOBEs.
ההבדלים בולטים: כאשר CBE ו-ABE ניתנים יחד ללא שימוש ב-MOBE, הצלבה מתרחשת עד 30% מהזמן. עם MOBE, הצלבה היא פחות מ-5%, תוך השגת יעילות המרה של 30% משינויי הבסיס הרצויים.
המחקר היווה הוכחה עקרונית לבדיקת היתכנות של מערכת MOBE, שקיבלה פטנט זמני. כדי לבדוק אותם עוד יותר, הצוות ערך כמה מחקרי מקרה עם מחלות אמיתיות, כולל תסמונת קלמן, הפרעה הורמונלית נדירה. הניסויים שלהם גילו שניתן להשתמש במערכות MOBE כדי לערוך ביעילות שורות תאים רלוונטיות של מחלות פוליגניות מסוימות.
"אנחנו בתהליך של הצבת הפלסמידים ב-AddGene כדי שכל אחד יוכל לגשת אליהם באופן חופשי. התקווה שלנו היא שחוקרים אחרים ישתמשו ב-MOBEs כדי ליצור מודל של מחלות גנטיות, ילמדו כיצד הן מתבטאות ואז בתקווה ליצור טיפולים יעילים", אמר קואן.
מחקר זה מומן בחלקו על ידי ה המכונים הלאומיים לבריאות (1R35GM138317, T32 GM008326 ו-T32 GM112584) ותאגיד המחקר לקידום המדע (28385).
רשימה מלאה של מחברים: קווין טי. קואן, סיפנג גו, וואנג'ון גו, ברודי ל. רנזאו, טאטום ס. סימונסון ואלכסיס סי קומור (כולם באוניברסיטת סן דייגו).
