PRINT, טכניקת ריפוי גנטי חדשה, משתמשת ברטרוטרנספוזונים שמקורם בציפורים כדי להחדיר גנים שלמים לאזור בטוח של הגנום האנושי, ומציעה גישה משלימה ל-CRISPR-Cas9 על ידי פוטנציאל לאפשר טיפול במחלות ללא סיכון להפרעה בגנים או לסרטן. קרדיט: twoday.co.il.com
רטרוטרנספוזונים יכולים להחדיר גנים חדשים ל"נמל בטוח" בגנום, משלימים את עריכת הגנים של CRISPR.
ההבהרה האחרונה של טיפול CRISPR-Cas9 למחלת תאי חרמש מדגישה את היעילות של טכנולוגיות עריכת גנים בנטרול גנים לריפוי מחלות תורשתיות. עם זאת, היכולת לשלב גנים שלמים בגנום האנושי כתחליף לגנים פגומים או מזיקים נותרה בלתי ניתנת להשגה.
טכניקה חדשה שמשתמשת ברטרוטרנספוזון מציפורים להחדרת גנים לגנום טומנת בחובה יותר הבטחה לטיפול גנטי, שכן היא מחדירה גנים ל"נמל בטוח" בגנום האנושי שבו ההחדרה לא תשבש גנים חיוניים או תוביל לסרטן.
רטרוטרנספוזונים, או רטרו-אלמנטים, הם חלקים של DNA זה, כאשר מתמלל RNA, קוד לאנזימים שמעתיקים את ה-RNA בחזרה ל-DNA בגנום – מחזור משרת עצמי שעושה את הגנום ב-DNA רטרוטרנספוזון. כ-40% מהגנום האנושי מורכב מה-DNA החדש ה"אנוכי" הזה, אם כי רוב הגנים מושבתים, מה שנקרא דנ"א זבל.
הטכניקה החדשה, הנקראת Precise RNA-mediated INsertion of Transgenes, או PRINT, ממנפת את היכולת של חלק מהרטרוטרנספוזונים להחדיר ביעילות גנים שלמים לגנום מבלי להשפיע על תפקודי גנום אחרים. PRINT ישלים את היכולת המוכרת של טכנולוגיית CRISPR-Cas להשבית גנים, ליצור מוטציות נקודתיות ולהחדיר מקטעים קצרים של DNA.
תיאור של PRINT, שפותח במעבדתה של קתלין קולינס, פרופסור לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת קליפורניה, ברקלי, פורסם לאחרונה בכתב העת טבע ביוטכנולוגיה.
PRINT כרוך בהחדרה של DNA חדש לתא תוך שימוש בשיטות מסירה דומות לאלו המשמשות להעברה של CRISPR-Cas9 לתאים לצורך עריכת גנום. עבור PRINT, חתיכה אחת של RNA שנמסר מקודדת לחלבון רטרו-אלמנט נפוץ שנקרא חלבון R2, שיש לו מספר חלקים פעילים, כולל ניקאז – אנזים הקושר וחותך DNA דו-גדילי – ותעתיק הפוך, האנזים שיוצר את עותק ה-DNA של RNA. ה-RNA האחר הוא התבנית ל-DNA הטרנסגן שיוכנס, בתוספת אלמנטים לבקרת ביטוי גנים – קלטת טרנסגנים אוטונומית שלמה שחלבון R2 מחדיר לגנום, אמר קולינס.
רטרוטרנספוזונים המצויים בגנום של הדרור הלבן-גרון והחוחית הזברה מראים בבטחה טרנסגנים לגנום האנושי, ומספקים גישת ריפוי גנטי המשלימה לעריכת גן CRISPR-Cas9. קרדיט: בריאנה ואן טריק, UC ברקלי
יתרון מרכזי בשימוש בחלבון R2 הוא בכך שהוא מחדיר את הטרנסגן לאזור בגנום המכיל מאות עותקים זהים של אותו גן – כל אחד מהם מקודד ל-RNA ריבוזומלי, מכונת ה-RNA שמתרגמת RNA שליח (mRNA) לחלבון. עם כל כך הרבה עותקים מיותרים, כאשר ההחדרה משבשת גן RNA ריבוזמלי אחד או כמה, איבוד הגנים לא יתפספס.
הכנסת הטרנסגן לנמל בטוח מונעת בעיה גדולה שנתקלת בה בעת החדרת טרנסגנים דרך אדם נגיף וקטור, שזו השיטה הנפוצה כיום: הגן מוחדר לעתים קרובות באופן אקראי לגנום, משבית גנים עובדים או מתעסק בוויסות או בתפקוד של גנים, שעלול להוביל לסרטן.
"גישה מבוססת CRISPR-Cas9 יכולה לתקן נוקלאוטיד מוטנטי או להחדיר כתם קטן של DNA – קיבוע רצף. או שאתה יכול פשוט לדפוק פונקציה של גנים על ידי מוטגנזה ספציפית לאתר", אמר קולינס, המחזיק בכיסא משפחת וולטר ורות שוברט. "אנחנו לא דופקים פונקציה של גנים. אנחנו לא מתקנים מוטציה של גן אנדוגני. אנחנו נוקטים בגישה משלימה, שהיא להכניס לגנום גן שבא לידי ביטוי אוטונומי שיוצר חלבון פעיל – להוסיף בחזרה גן פונקציונלי כמעקף גירעון. זה תוספת טרנסגנים במקום היפוך מוטציה. לתקן מחלות אובדן תפקוד הנובעות ממגוון של מוטציות בודדות של אותו גן, זה נהדר".
"הזוכים האמיתיים היו מציפורים"
מחלות תורשתיות רבות, כמו סיסטיק פיברוזיס והמופיליה, נגרמות ממספר מוטציות שונות באותו גן, כולן משביתות את תפקוד הגן. כל טיפול לעריכת גנים מבוסס CRISPR-Cas9 יצטרך להיות מותאם למוטציה הספציפית של אדם. תוספי גנים באמצעות PRINT יכולים במקום זאת לספק את הגן הנכון לכל אדם עם המחלה, ולאפשר לגוף של כל חולה לייצר את החלבון הרגיל, לא משנה מהי המוטציה המקורית.
מעבדות וסטארטאפים אקדמיים רבים חוקרים את השימוש בטרנספוזונים ורטרוטרנספוזונים כדי להחדיר גנים לטיפול גנטי. רטרוטרנספוזון פופולרי אחד שנחקר על ידי חברות ביוטכנולוגיה הוא LINE-1 (Long INTEspersed Element-1), שבבני אדם שכפל את עצמו וכמה גנים של טרמפיסטים כדי לכסות כ-30% מהגנום, אם כי פחות מ-100 מהרטרוטרנספוזון LINE-1 של הגנום שלנו עותקים מתפקדים היום, חלק זעיר מהגנום.
קולינס, יחד עם עמית הפוסט-דוקטורט מאוניברסיטת ברקלי, אקאנקשה ת'וואני ואווה נוגלס, פרופסור נכבד באוניברסיטת ברקלי במחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית וחוקר במכון הרפואי הווארד יוז, פרסמו מבנה מיקרוסקופי קריואלקטרון של חלבון האנזים המקודד על ידי הרטרו-אלמנט LINE-1 ב-14 בדצמבר ביומן טֶבַע.
מחקר זה הבהיר, אמר קולינס, כי יהיה קשה להנדס את חלבון הרטרוטרנספוזון LINE-1 כדי להחדיר בצורה בטוחה ויעילה טרנסגן לגנום האנושי. אבל מחקרים קודמים שהוכיחו שגנים שהוכנסו לאזור המקודד RNA החוזר והריבוזומלי של הגנום (ה-rDNA) באים לידי ביטוי בדרך כלל הציעו לקולינס שרטרו-אלמנט אחר, הנקרא R2, עשוי לעבוד טוב יותר להחדרה בטוחה של טרנסגן.
מכיוון ש-R2 אינו נמצא בבני אדם, קולינס והחוקרת הבכירה שיאוז'ו ג'אנג ועמיתת הפוסט-דוקטורט בריאנה ואן טריק, שניהם מאוניברסיטת ברקלי, סקרו את R2 מיותר מעשרות של גנומים של בעלי חיים, מחרקים ועד סרטן פרסה ואיקריוטים רב-תאיים אחרים, כדי למצוא גרסה שהייתה ממוקדת מאוד לאזורי rDNA בגנום האנושי ויעילה בהחדרת אורכים ארוכים של DNA לאזור.
"אחרי שרדפו אחרי עשרות מהם, המנצחים האמיתיים היו מציפורים", אמר קולינס, כולל חוחית הזברה והדרור הלבן-גרון.
בעוד שליונקים אין R2 בגנום שלהם, יש להם את אתרי הקישור הדרושים ל-R2 כדי להחדיר ביעילות כרטרו-אלמנט – כנראה סימן, לדבריה, לכך שלקודמי היונקים היה רטרו-אלמנט דמוי R2 שאיכשהו נבעט ממנו. הגנום של היונקים.
בניסויים, Zhang ו-Van Treeck סינתזו חלבון R2 המקודד ל-mRNA ו-RNA תבנית שייצור טרנסגן עם חלבון ניאון המתבטא על ידי מקדם פולימראז של RNA. אלה הועברו במקביל לתאים אנושיים מתורבתים. כמחצית מהתאים נדלקו בירוק או אדום עקב ביטוי חלבון ניאון תחת אור לייזר, מה שמוכיח שמערכת R2 החדירה בהצלחה חלבון פלואורסצנטי עובד לגנום.
מחקרים נוספים הראו כי הטרנסגן אכן נכנס לאזורי ה-rDNA של הגנום וכי ניתן להחדיר כ-10 עותקים של תבנית ה-RNA מבלי לשבש את פעילות ייצור החלבון של גני ה-rDNA.
מרכז ביוגנזה של ריבוזומים ענק
החדרת טרנסגנים לאזורי rDNA של הגנום היא יתרון מסיבות שאינן נותנות להם נמל בטוח. אזורי ה-rDNA נמצאים על הזרועות הקשוחות של חמישה כרומוזומים נפרדים. כל הזרועות הקשוחות הללו מצטופפות זו לזו ויוצרות מבנה הנקרא הגרעין, שבו ה-DNA מתעתק ל-RNA ריבוזמלי, שלאחר מכן מתקפל לתוך המנגנון הריבוזומלי שמייצר חלבונים. בתוך הגרעין, שעתוק rDNA מווסת מאוד, והגנים עוברים תיקונים מהירים, שכן כל שבירה של rDNA, אם משאירה לה להתפשט, עלולה להפסיק את ייצור החלבון. כתוצאה מכך, כל טרנסגן המוכנס לאזור ה-rDNA של הגנום יטופל בכפפות ילדים בתוך הגרעין.
"הגרעין הוא מרכז ביוגנזה של ריבוזומים ענק", אמר קולינס. "אבל זו גם סביבת תיקון DNA מיוחסת עם סיכון אונקוגני נמוך מהחדרת גנים. זה מבריק שהרטרו-אלמנטים המוצלחים האלה – אני אנתרופומורפיזם אותם – נכנסו ל-DNA הריבוזומלי. זה ריבוי עותקים, זה שמור, וזה נמל בטוח במובן זה שאתה יכול לשבש אחד מהעותקים האלה ולתא לא אכפת".
זה הופך את האזור למקום אידיאלי להחדרת גן לטיפול גנטי בבני אדם.
קולינס הודה שהרבה עדיין לא ידוע על איך R2 עובד ושעדיין נותרו שאלות לגבי הביולוגיה של שעתוק rDNA: כמה גנים של rDNA יכולים להיות מופרעים לפני שהתא ידאג? מכיוון שתאים מסוימים מכבים רבים מהגנים של 400+ rDNA בגנום האנושי, האם תאים אלו רגישים יותר לתופעות לוואי של PRINT? היא והצוות שלה חוקרים את השאלות הללו, אך גם משנים את החלבונים וה-RNA השונים המעורבים בהחדרת רטרו-אלמנטים כדי לגרום ל-PRINT לעבוד טוב יותר בתאים מתורבתים ובתאים ראשוניים מרקמות אנושיות.
השורה התחתונה, עם זאת, היא ש"זה עובד", אמרה. "זה רק שאנחנו צריכים להבין קצת יותר על הביולוגיה של ה-rDNA שלנו כדי באמת לנצל את זה."
מחברים שותפים אחרים של ה טבע ביוטכנולוגיה המאמר הם סטודנטים לתארים מתקדמים באוניברסיטת ברקלי, קונור הורטון, ג'רמי מקינטייר, שרה פאלם וג'סטין שומט. העבודה נתמכה על ידי ה המכונים הלאומיים לבריאות (F32 GM139306, DP1 HL156819, T32 GM07232) ו-Shurl and Kay Curci Foundation. קולינס הגישה בקשה לפטנטים על PRINT, והקימה חברה, Addition Therapeutics, כדי לפתח את PRINT כטיפול גנטי.
